Laboratório de Andrologia

O Laboratório de Andrologia da Androfert coloca, ao seu dispor, um arsenal completo de exames para avaliar a fertilidade masculina. O elevado padrão de qualidade é uma das características deste Laboratório. Os resultados são precisos e confiáveis. Nosso Laboratório mantém parceria com o Laboratório de Andrologia da Fundação "Cleveland Clinic", nos EUA, que vem sendo considerado há mais de 5 anos o melhor Laboratório de Andrologia daquele País. Este sistema de parceria inclui intercâmbio entre os profissionais de ambas as Instituições, com visitas periódicas, constante reciclagem, além do desenvolvimento de pesquisas conjuntas.

1) Análise completa do Sêmen

A análise do sêmen é um dos primeiros exames solicitados para avaliar a fertilidade masculina. Nos dias atuais, esta análise vai muito além de um simples espermograma. Ela engloba uma série de testes que avaliam o potencial de fecundidade dos espermatozóides. Para realizá-la, solicita-se a abstenção da atividade sexual ou masturbação por um período de 48 a 72 horas. O método ideal para a coleta da amostra de sêmen é a masturbação, numa sala apropriada anexa ao laboratório. O frasco para a coleta deve ser fornecido pelo laboratório, o qual deve ser de boca larga e de material previamente testado quanto à toxicidade para a motilidade espermática.

A coleta domiciliar segue as mesmas orientações, porém o frasco deverá ser mantido próximo ao corpo durante o transporte até o laboratório, para diminuir as variações térmicas, e o espécime deverá ser examinado dentro de 1 hora da coleta. Situações especiais podem ser contornadas, como a coleta durante o ato sexual, utilizando-se preservativos atóxicos, vibroestimulação ou eletroejaculação nos homens com trauma de medula espinhal, e na ejaculação retrógrada.


1.1. Espermograma

A avaliação da fertilidade masculina começa com o espermograma. Este exame é importante para verificar, inicialmente, se o volume do esperma, o pH (acidez), a viscosidade, a cor e a liquefação do sêmen estão normais. Em seguida, determina-se o número de espermatozóides além da motilidade dos mesmos, tanto do ponto de vista quantitativo quanto qualitativo. A contagem do número de espermatozóides e a avaliação da motilidade são realizadas no microscópio, com auxílio de câmaras especiais, especialmente desenvolvidas para este fim. O espermograma inclui ainda a avaliação da morfologia (formato) dos espermatozóides, e a determinação do número de leucócitos (glóbulos brancos) presentes no sêmen, testes estes que serão detalhados a seguir.

1.2. Morfologia Estrita

 A forma (morfologia) dos espermatozóides humanos varia amplamente. A definição de um padrão de normalidade baseia-se na observação da forma dos espermatozóides que conseguiram ultrapassar o canal endocervical (colo uterino). A análise da morfologia é tão importante na análise do sêmen quanto a determinação do número de espermatozóides e da sua motilidade. O estudo da morfologia é um dos indicadores da qualidade dos espermatozóides que estão sendo produzidos pelos testículos, e os resultados desta, principalmente quando avaliada pela técnica estrita de Kruger, correlacionam-se com o sucesso da fertilização "in vitro", da inseminação intra-uterina, e também com a chance de conseguir a gravidez por via natural. Em um estudo por nós realizado, avaliando 26 homens com varicocele (varizes ao redor do testículo que podem causar infertilidade) e menos de 14% de espermatozóides morfologicamente normais, verificamos que a correção microcirúrgica da varicocele melhorou os resultados da morfologia estrita de Kruger em 50% dos casos, e tal melhora foi acompanhada de taxas de gravidez mais elevadas, quando comparadas ao grupo de homens cuja morfologia não se alterou após a cirurgia (Esteves & Nakazato, Congresso da Associação Americana de Medicina Reprodutiva, Toronto, Canadá, 1999). Para a análise da morfologia, os espermatozóides são corados com corantes especiais, e examinados no microscópio óptico num aumento de 1000 vezes. No nosso laboratório, utilizamos colorações de alta qualidade e que oferecem resultados precisos: Diff-Quik (Dade Diagnostics, Miami, FL, USA) e Spermac (Stain Enterprises, South Africa). A análise da morfologia pela técnica estrita de Kruger é uma arma valiosa durante a investigação do casal com dificuldade para ter filhos. Entretanto, só pode ser realizada por técnicos altamente experientes em Laboratórios especializados, como o nosso Laboratório de Andrologia. Sistemas de classificação morfológica. O espermatozóide normal apresenta cabeça com formato oval e superfície regular, sem defeitos na peça intermediária ou cauda. O critério estrito (a seguir) deve ser utilizado para definir o espermatozóide normal. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, os espermatozóides anormais podem apresentar os seguintes defeitos: Defeitos no formato/tamanho da cabeça; Defeitos de peça intermediária; Defeitos na cauda;

1.3. Teste Hipo-Osmótico (THO)

É um teste que avalia a integridade funcional da membrana plasmática dos espermatozóides, e o transporte de água através da mesma. Baseia-se na observação de que espermatozóides cujas membranas estão íntegras absorvem água, quando expostos à uma solução hiposmolar em relação ao meio intracelular, e são capazes de manter um gradiente osmótico, enquanto aqueles com membranas lesadas não o fazem. Neste teste, os espermatozóides com membranas íntegras, e portanto vivos, exibem "inchaço" da cauda quando colocados em uma solução hiposmolar (150 mOsm) em relação ao meio intracelular, e tais alterações morfológicas podem ser apreciadas à microscopia de contraste de fase. Por outro lado, espermatozóides cujas membranas plasmáticas estão lesadas não apresentam capacidade osmo-reguladora e, conseqüentemente, não exibem o inchaço da cauda. Embora o THO tenha sido originalmente descrito como um teste de função espermática, correlacionando-se com os resultados do teste de penetração em óvulos de hamster, outros estudos não confirmaram tal propriedade. Atualmente, o THO tem sido utilizado como um teste de vitalidade espermática, com a vantagem de não utilizar qualquer corante. Nós também temos utilizado este teste para identificar espermatozóides que embora imóveis sejam viáveis, nas técnicas de injeção intracitoplasmática (ICSI). A presença de apenas espermatozóides imóveis após a ejaculação pode ocorrer quando os mesmos são retirados do testículo, nos indivíduos com azoospermia (ausência de espermatozóides) de causa não-obstrutiva, na síndrome de imotilidade ciliar, e após a vibroestimulação ou a eletroejaculação nos paraplégicos.


1.4. Determinação de Leucócitos no Sêmen

É comum a presença de células redondas no sêmen, que podem representam leucócitos, células epiteliais, células prostáticas e células germinativas imaturas. O aumento do número de leucócitos pode representar uma infecção genital clínica ou subclínica, níveis elevados de radicais livres de oxigênio, títulos elevados de anticorpos anti-espermatozóides, e função espermática deficiente. Todas estas condições podem ocasionar infertilidade masculina. Daí a importância da determinação do número de leucócitos no sêmen, que pode ser realizada por meio do teste da peroxidase. Este teste identifica e quantifica os neutrófilos polimorfonucleares, que representam a maioria dos leucócitos presentes no sêmen, de maneira precisa.

O teste baseia-se na detecção da peroxidase, enzima presente nos granulócitos polimorfonucleares (PMN), os quais se coram em marrom quando expostos ao teste (peroxidase-positivos).
As células peroxidase-negativas (não-coradas) podem representar células germinativas imaturas (espermátides, espermatócitos e espermatogônias), linfócitos, macrófagos e monócitos.

1.5. Reação Acrossômica

O acrossomo do espermatozóide contém as enzimas proteolíticas que digerem a zona pelúcida do oócito, permitindo que o gameta masculino fertilize o gameta feminino. A liberação dessas enzimas é fundamental para a fertilização, e tal processo denomina-se reação acrossômica. A determinação da reação acrossômica é complexa e pode ser medida laboratorialmente. Os resultados obtidos correlacionam-se com o potencial de fecundidade do espermatozóide. Homens com dificuldades para ter filhos, de causa indeterminada, podem apresentar níveis baixos ou mesmo ausência de reação acrossômica, explicando assim, porque os espermatozóides não conseguem fertilizar o óvulo. A reação acrossômica é um teste que avalia o potencial fértil do espermatozóide, e deve ser utilizado principalmente naqueles casos onde houve falha em tentativas anteriores de fertilização "in vitro".

2) Teste para avaliação Imunológica

Permite investigar se a infertilidade tem caráter imunológico. As indicações para esse tipo de análise incluem teste pós-coito alterado, aglutinação espermática, motilidade diminuída, ou simplesmente infertilidade de causa inexplicada.

2.1) Teste para detectar Anticorpos Anti-Espermatozóides

Em alguns homens, a dificuldade para ter filhos ocorre porque o seu próprio organismo produz defesas contra os espermatozóides (anticorpos anti-espermatozóides), defesas estas que bloqueiam a fecundação. Vários fatores de risco podem induzir a formação de anticorpos anti-espermatozóides, incluindo as infecções genitais, traumatismos ou cirurgias nos testículos, varicocele (varizes testiculares), entre outras. O melhor método atualmente disponível para a detecção desses anticorpos é o "teste de immunobeads", que utilizamos no nosso laboratório. Este teste utiliza esferas de poliacrilamida ligadas a anticorpos anti-imunoglobulinas humanas, e é capaz de detectar IgA, IgG e IgM, os tipos mais importantes na infertilidade imunológica, com grande exatidão, seja no plasma sanguíneo, plasma seminal ou no muco do colo do útero da esposa. Se mais de 20% dos espermatozóides tiverem anticorpos na sua superfície, haverá dificuldade para a gravidez natural. Nestes casos, existem tratamentos que solucionam o problema.

3) Processamento Seminal

Em todas as situações onde houver indicação de reprodução assistida (RA), seja esta de baixa complexidade (ex. inseminação artificial), ou de alta complexidade (ex. fertilização "in vitro" (FIV), com ou sem micromanipulação de gametas [ICSI]), deve-se realizar o processamento dos espermatozóides no laboratório, seja para selecionar os melhores gametas, remover toxinas e contaminantes, ou melhorar o potencial fértil dos espermatozóides. Quando o processamento é realizado no dia da inseminação ou fertilização "in vitro", ele é denominado processamento terapêutico, porque os espermatozóides selecionados serão utilizados no tratamento. Por outro lado, quando este é realizado durante a fase de investigação do casal, ou seja, na fase de exames de laboratório, denominamos processamento diagnóstico. Neste caso, o exame serve para determinar qual o número de espermatozóides considerados de boa qualidade, que foram recuperados após o processamento.

O número de espermatozóides recuperados é um dos critérios que nos auxilia na escolha da técnica de reprodução assistida mais apropriada para o casal. No nosso laboratório, o processamento do sêmen é realizado pelas técnicas de "swim-up" e do gradiente descontínuo coloidal. Em casos especiais, dispomos ainda de técnicas para melhorar a fecundidade dos espermatozóides, e de técnicas para amadurecer os espermatozóides imaturos no laboratório (maturação "in vitro").

3.1) Técnica de SWIM-UP

Baseia-se na velocidade de progressão direcional dos espermatozóides. A técnica de 'swim-up" elimina o plasma seminal, debris, material amorfo, células esfoliativas, espermatozóides mortos, imóveis e aqueles sem velocidade de progressão direcional. Ao final, obtém-se uma amostra limpa contendo espermatozóides que exibem excelente motilidade. A técnica de "swim-up" recupera cerca de 20% dos espermatozóides móveis presentes no ejaculado inicial. A principal vantagem do "swim-up" é a recuperação de celulas de alta qualidade, embora o número de espermatozóides não seja tão elevado, principalmente quando a motilidade inicial da amostra é baixa.


3.2) Técnica dos gradientes descontínuos coloidais

Baseia-se na aplicação de uma força centrífuga sobre os espermatozóides e outros elementos particulados do sêmen, obrigando-os a vencer gradientes de densidades diferentes. Este método é mais rápido e geralmente recupera maior proporção de espermatozóides móveis do que a técnica de "swim-up", em todos os tipos de infertilidade masculina. Entretanto, a qualidade final da motilidade é inferior àquela obtida com o "swim-up". Para a preparação dos gradientes, a substância mais utilizada atualmente é a sílica estabilizada com silano hidrofílico, disponível pronta para uso em diversas apresentações comerciais (Enhance-S®, Isolate®, Puresperm®, etc.).
 

3.3) Técnicas para estimular a motilidade dos Espermatozóides no Laboratório

É possível melhorar a fecundidade dos espermatozóides através do uso de estimulantes. Dentre todas as substâncias estudadas e testadas clinicamente, a pentoxifilina é a que oferece os maiores benefícios. O uso da pentoxifilina no preparo do sêmen para reprodução assistida melhora a motilidade espermática e otimiza a capacidade do espermatozóide fertilizar o óvulo. Além disso, a pentoxifilina atua como anti-oxidante, impedindo a formação de radicais livres de oxigênio. A resposta à pentoxifilina varia individualmente, sendo necessário testar previamente sua eficácia. Nós utilizamos a pentoxifilina de 2 maneiras: (1) adicionada diretamente ao sêmen, ou (2) adicionada aos espermatozóides selecionados pelas técnicas de processamento do sêmen. No 1º caso, o intuito é aumentar a motilidade espermática e a capacidade anti-oxidante do sêmen, visando obter um número maior de espermatozóides recuperados após o processamento do sêmen, e com capacidade funcional superior. Assim sendo, os espermatozóides tratados com a pentoxifilina serão utilizados para a inseminação intra-uterina ou fertilização in vitro, com melhores chances de gravidez. Nós também utilizamos a pentoxifilina para melhorar a fecundidade do sêmen criopreservado (congelado), quando este apresenta baixa qualidade após o descongelamento. No 2º caso, o objetivo é aumentar as taxas de fertilização "in vitro", principalmente nos casos de falha prévia de fertilização.

4) Análise Bioquímica do Sêmen

O sêmen não é composto apenas por espermatozóides. Na verdade, estes representam a menor parte. O líquido que transporta os espermatozóides (plasma seminal) é produzido por glândulas, chamadas vesículas seminais, e também pela próstata. Este líquido contém várias substâncias, que são importantes para conservar os espermatozóides. A falta destas substâncias pode diminuir a qualidade do sêmen. Embora existam testes para a determinação destes marcadores, não se sabe ainda ao certo o papel de cada uma delas. Exceção a esta regra é a determinação da frutose, um açúcar presente no plasma seminal, que consiste na fonte de energia para os espermatozóides. A frutose pode estar ausente ou diminuída em várias condições que causam infertilidade masculina. A ausência de frutose pode indicar a ausência congênita bilateral dos canais deferentes ou a obstrução bilateral dos ductos ejaculadores.

5) Ensaios Imuno-Enzimáticos

São exames de sangue, realizados para verificar a produção dos hormônios sexuais masculinos e femininos. Estes hormônios regulam a produção dos espermatozóides, no homem, e a ovulação, na mulher. Na mulher, rotineiramente realiza-se a dosagem sanguínea dos seguintes hormônios: folículo-estimulante (FSH), hormônio luteinizante (LH), prolactina (PRL), estradiol (E2), e progesterona (P4). No homem, além do FSH, LH e PRL, dosa-se também os níveis da testosterona, que é o principal hormônio masculino produzido pelos testículos.

Referências Bibliográficas

1. Mortimer D. Semen analysis. In: Practical Laboratory Andrology. Oxford University Press, New York, 1994.

2.World Health Organization (WHO): Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction. 4th. ed. Cambridge. The Press Syndicate of the University of Cambridge, 1999 (www.cup.cam.ac.uk) .

3.Esteves, S.C., Nakazato, L.T. Espermograma e correlações clínicas. In: Neves, P.A., Netto Jr., N.R. Infertilidade Masculina; Editora Atheneu; São Paulo; Brasil; pp. 59-70, 2002.

4. Rhoden, E.L., Soares, J.B., Esteves, S.C. O que o laboratório pode fazer pelo espermatozóide. In: II consenso Brasileiro de Infertilidade Masculina. São Paulo, Outubro 2003, pág. 97-108.